高質量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封鎖劑使用，但因為奶粉的成份復雜，而且封鎖后的載體不易長期保留，因此在試劑盒的制備中較少應用。ELISA試劑盒封鎖的手續與包被相類似。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操縱時洗滌*，不經封鎖也可得到滿足的結果。封鎖是否必要，取決于ELISA的模式及詳細的實驗前提。
封鎖（blocking）是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保留數月。ELISA試劑盒包被的zui適當濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協調選定。但在間接法測定中，封鎖一般是不可少的。
zui常用的封鎖劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封鎖劑的。一般蛋白質的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。ELISA試劑盒抗原或抗體包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據的曠地空閑，封鎖就是讓大量不相關的蛋白質充填這些曠地空閑，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。
包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應根據試驗的特點和材料的性質而選定。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被以為具有平等的包被效果。特別是用單抗腹水直接包被時，因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面，業已起到了類似封鎖劑的作用。并非所有的ELISA固相均需封鎖，封鎖不當反而會使陰性本底增高。ELISA試劑盒脫脂奶粉也是一種良好的封鎖劑，其zui大的特點是價廉，可以高濃度使用（5%）。抗體和蛋白質抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。
